Panduan KlinisJurnal Medis
Kembali ke daftar guideline

Digital Clinical Library

2019 Litbang Diagnosis Laboratoris Leptospirosis

16 Desember 2025LitbangTropik Infeksi
Lihat PDF

BUKU DIAGNOSIS LABORATORIS LEPTOSPIROSIS

Penerbit: Lembaga Penerbit Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Balitbangkes), Kementerian Kesehatan RI Tahun: 2019 ISBN: 978-602-373-160-2 Penulis: Farida Dwi Handayani, Ristiyanto, Arum Sih Joharina, dkk.

BAB I: PENDAHULUAN

A. Tinjauan Umum Leptospirosis

Leptospirosis adalah infeksi zoonosis yang disebabkan oleh bakteri Leptospira sp. (Spirochaeta Gram-negatif) .

  • Reservoir: Tikus adalah reservoir utama; bakteri hidup di tubulus ginjal dan diekskresikan melalui urin .
  • Epidemiologi: Merupakan re-emerging disease yang sering terjadi wabah di negara tropis seperti Indonesia .
  • Masa Inkubasi: Berkisar 2–21 hari, biasanya 7–14 hari .

B. Perjalanan Klinis

Penyakit ini memiliki fase bifasik (biphasic) :

  1. Fase Akut (Leptospiremia):
    • Berlangsung 4–7 hari.
    • Gejala: Demam, sakit kepala, menggigil, nyeri otot, mual, diare.
    • Bakteri dapat ditemukan dalam darah dan cairan serebrospinal .
  2. Fase Imun (Leptospiruria):
    • Ditandai dengan munculnya antibodi IgM dan ditemukannya bakteri dalam urin.
    • Komplikasi berat (Sindrom Weil): Ikterus, gagal ginjal, perdarahan paru, hingga kematian .

C. Bakteriologi Leptospira

  • Morfologi: Berbentuk heliks/spiral, ukuran panjang 6–20 µm, tebal 0,1 µm. Ujungnya melengkung seperti mata pancing (hook). Tidak terlihat dengan mikroskop cahaya biasa, harus menggunakan Mikroskop Medan Gelap (Dark Field Microscope) atau pewarnaan perak (Silver Staining) .
  • Pertumbuhan: Aerob obligat, suhu optimal 28–30°C, pH 7–8. Waktu regenerasi 7–12 jam .
  • Ketahanan: Dapat bertahan hidup di tanah lembab/basah pH netral, namun mati cepat di air payau/salinitas tinggi .

D. Klasifikasi

  1. Fenotipik:
    • L. interrogans (Patogen): Peka terhadap 8-azaguanine, tidak tumbuh pada suhu 13°C .
    • L. biflexa (Non-patogen/Saprofita): Resisten terhadap 8-azaguanine, tumbuh pada suhu 13°C.
    • Identifikasi serovar menggunakan Cross Agglutination Absorption Test (CAAT) .
  2. Genetik:
    • Berdasarkan homologi DNA, terdapat 22 spesies genomik .
    • Memiliki 2 kromosom (besar dan kecil) .

E. Media Kultur

Leptospira membutuhkan asam lemak rantai panjang (long chain fatty acid) sebagai sumber energi, vitamin B1, dan B12 .

  1. Media Serum Kelinci: Contoh media Korthof, Fletcher, Stuart. Digunakan untuk isolasi klinis, namun tidak untuk preparasi antigen MAT .
  2. Media EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris): Mengandung albumin untuk mengikat asam lemak bebas yang toksik. Digunakan untuk perbanyakan antigen MAT .
  3. Media Bebas Protein: Menggunakan arang aktif (charcoal) sebagai detoksikan .
  4. Media Selektif: Ditambahkan 5-fluorouracil (5-FU) untuk menghambat kontaminan bakteri lain .

BAB II: PROSEDUR PENGAMBILAN SAMPEL

Skrining leptospirosis di laboratorium diawali dengan pengambilan sampel di lapangan untuk bahan uji. Jenis sampel yang umum diambil meliputi urin, darah, serum, dan ginjal .

A. Prosedur Pengambilan Sampel Manusia

Pengambilan sampel darah vena dilakukan menggunakan spuit atau tabung vakum.

1. Persiapan Alat dan Bahan

  • Syringe (3cc, 5cc) atau Holder & jarum.
  • Tali pembendung (torniket).
  • Tabung Vacutainer:
    • EDTA: Untuk uji PCR .
    • Heparin: Untuk kultur Leptospira .
    • Non-EDTA: Untuk serum .

2. Langkah Kerja

  1. Informed Consent: Jelaskan prosedur kepada pasien dan minta tanda tangan persetujuan .
  2. Persiapan Pasien: Verifikasi identitas dan kondisi pasien (puasa/obat). Minta pasien meluruskan lengan dan mengepalkan tangan .
  3. Pemasangan Torniket: Pasang kira-kira 10 cm di atas lipat siku .
  4. Lokasi Vena: Pilih vena median cubital atau cephalic. Lakukan palpasi untuk memastikan posisi vena (teraba seperti pipa kecil elastis) .
  5. Desinfeksi: Bersihkan area dengan alkohol 70% dan biarkan kering .
  6. Pengambilan Darah:
    • Tusuk vena dengan posisi lubang jarum menghadap ke atas .
    • Jika menggunakan tabung vakum, masukkan tabung ke dalam holder hingga darah mengalir .
    • Jika memerlukan beberapa tabung, ganti tabung setelah tabung pertama terisi .
  7. Penyelesaian: Lepas torniket, minta pasien membuka kepalan tangan, tarik jarum, dan tekan bekas suntikan dengan kapas lalu plester .

B. Prosedur Pengambilan Sampel Tikus (Reservoir)

1. Pengambilan Darah dan Koleksi Serum

Alat dan Bahan: Syringe (1 ml/3 ml), tabung vacutainer non-EDTA, centrifuge, Ketamin & Xylasin .

Langkah Kerja:

  1. Anestesi: Suntikkan campuran Ketamin (70-100 mg/kgBB) dan Xylasin (2 mg/kgBB) pada paha belakang tikus. Tunggu 5-10 menit hingga efek bekerja .
  2. Cardiac Puncture:
    • Bersihkan dada tikus dengan alkohol swab .
    • Tusukkan jarum di bawah tulang rusuk dengan sudut 45° terhadap badan tikus. Arahkan ke jantung hingga darah mengalir masuk ke syringe .
  3. Koleksi Serum:
    • Masukkan darah ke tabung vacutainer non-EDTA (lewat dinding tabung perlahan untuk hindari hemolisis) .
    • Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit .
    • Ambil serum (cairan bening di atas) dan simpan dalam cryotube pada suhu 4°C sebelum pemeriksaan .

2. Pengambilan Ginjal Tikus

Ginjal diambil untuk mendeteksi koloni Leptospira yang menetap di tubulus ginjal reservoir.

Alat dan Bahan: Gunting bedah, pinset, vial kaca ulir, alkohol 70% .

Langkah Kerja:

  1. Letakkan tikus yang sudah dianestesi pada nampan bersih dan desinfeksi area perut .
  2. Pembedahan:
    • Jepit kulit perut bawah, gunting menembus kulit dan otot perut.
    • Buat potongan lurus dari perut ke arah dada .
    • Tarik kulit dan otot di atas diafragma untuk mengekspos rongga perut sepenuhnya .
  3. Koleksi Organ:
    • Ambil kedua ginjal.
    • Masukkan ke dalam vial kaca berisi alkohol 70% .
    • Simpan pada suhu ruang sebelum pemeriksaan lebih lanjut .

BAB III: PROSEDUR PEMERIKSAAN

Pemeriksaan laboratorium untuk leptospirosis dibagi menjadi pemeriksaan serologis dan molekuler .

A. Pemeriksaan Serologis: Microscopic Agglutination Test (MAT)

MAT merupakan standar baku emas (gold standard) diagnosis leptospirosis karena spesifisitasnya yang tinggi .

1. Prinsip Kerja

  • Berdasarkan reaksi antigen-antibodi.
  • Serum penderita direaksikan dengan suspensi panel serovar Leptospira hidup.
  • Aglutinasi (penggumpalan) dilihat di bawah mikroskop medan gelap (Dark Field Microscope) .

2. Alat dan Bahan

  • Plate MAT, Mikroskop medan gelap, Inkubator, Micro shaker.
  • Serum pasien/hewan, Kultur Leptospira (panel antigen), PBS 1x .

3. Prosedur Pemeriksaan

  1. Pengenceran: Lakukan serial dilusi serum mulai dari pengenceran 1:20 dalam PBS .
  2. Penambahan Antigen: Tambahkan 50 µl kultur Leptospira hidup ke dalam sumuran .
  3. Inkubasi: Campur dengan shaker dan inkubasi selama 2–4 jam pada suhu 37°C .
  4. Pembacaan: Periksa di bawah mikroskop medan gelap. Positif jika terjadi aglutinasi dengan titer tertentu (misal cut-off 1:20 untuk surveilans tikus) .

B. Pemeriksaan Molekuler

Metode ini mendeteksi DNA Leptospira menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).

1. Ekstraksi DNA

Proses mengeluarkan DNA dari sampel (urin, darah, atau jaringan ginjal) melalui tahapan lisis, pengikatan (binding), pencucian (washing), dan elusi .

  • Sampel Urin: Sentrifugasi kecepatan tinggi, cuci pelet dengan PBS, lisis dengan Proteinase K, lalu purifikasi menggunakan spin column .
  • Sampel Darah/Serum: Lisis dengan Buffer AL dan Proteinase K pada suhu 56°C, ikatkan ke kolom silika, cuci dengan etanol/wash buffer, dan elusi .
  • Sampel Ginjal: Gerus bagian korteks ginjal, lisis semalaman pada suhu 55°C, lalu ekstraksi sesuai protokol .

2. PCR Konvensional

Mendeteksi gen spesifik (seperti LipL32 atau secY) dan divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarose .

  • Primer: Menggunakan primer forward dan reverse spesifik.
  • Siklus Thermal:
    • Predenaturasi: 95°C (5 menit).
    • Denaturasi: 94°C (30 detik).
    • Annealing: 58°C (30 detik).
    • Ekstensi: 72°C (1 menit).
    • Siklus diulang 35x, diakhiri ekstensi akhir 7 menit .
  • Visualisasi: Elektroforesis pada gel agarose 1,5% - 2% dengan pewarna DNA (Ethidium Bromide/Sybr Safe) .

3. Real Time PCR (qPCR)

Metode yang lebih sensitif dan cepat, menggunakan pewarna fluoresens (seperti EvaGreen) untuk memantau amplifikasi secara real-time .

  • Target: Gen secY atau target spesifik lain .
  • Protokol Suhu: Denaturasi 95°C, Annealing 60°C (40 siklus), dilanjutkan dengan analisis Melt Curve (65-95°C) untuk memastikan spesifisitas produk .

4. Sequencing DNA

Dilakukan untuk menentukan spesies dan serovar secara genotipik dengan membaca urutan basa DNA .

  • Tahapan:
    1. Purifikasi produk PCR (menghilangkan sisa primer/dNTP) .
    2. Cycle Sequencing menggunakan BigDye terminator.
    3. Purifikasi produk sekuensing (presipitasi etanol/EDTA).
    4. Elektroforesis Kapiler (Capillary Electrophoresis) pada mesin sekuenser .
  • Analisis: Hasil sekuens dibandingkan dengan database GenBank menggunakan software bioinformatika (misal BioEdit) untuk identifikasi .